分离度的计算及其影响因素
1. 分离度定义
在HPLC或者GC色谱中，分离度用以衡量相邻洗脱组分的分离情况，是将色谱柱分离效率与流动相效率综合在一起的一个参数，分离度越大，相邻两组分分离地越好。一般地，分离度小于1时，两色谱峰重叠较严重；分离度等于1(4σ)时，两组分被彻底分离部分占98%，对每个色谱峰来说，其峰纯度亦为98%；分离度为1.5(6σ)时，两组分被彻底分离部分占99.7%，通常以R=1.5作为相邻两组分完全分离的标志。对于色谱峰积分面积比为1：1的两组分的分离情况与分离度的关系，如下图1A与1B所示。
1.1.分离度的计算
对于分离度的计算有以下几种方法：
(1)利用保留时间以及基线峰宽，按照下式1进行计算；
(2)利用保留时间以及半峰宽，按照下式2进行计算；
各参数意义详见下图2所示。
(3)利用色谱柱柱效(N)，分离因子(α)以及保留时间较长的组分的容量因子(K)，按照下式2进行计算；
上述三个公式，理论上都可以对分离度进行计算，但公式3需要得到色谱柱的柱效，而对色谱柱而言，针对不同的化合物其柱效是不一样的，尽管仪器操作条件完全相同。因此，该式更多应用于理论推导。
上述公式1与公式2则更多应用于实际色谱图中相邻洗脱组分色谱峰分离度的计算。对于公式1，其应用范围是两色谱峰基本基线分离及其以上的情况，因为该式需要测定明确的基线峰宽；当基线峰宽不能明确测量时(如两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，如图3所示)，则比较适宜选择公式2计算分离度，因为该式测量的是半峰高处的峰宽。
1.2.峰高比法预测分离度
公式1以及公式2可解决基线分离以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值小于50%时，对于两相邻色谱峰分离度的计算需求。当两相邻组分色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值大于50%时(如图4所示)，由于无法精确测量基线峰宽以及半峰高峰宽，使用公式1以及公式2计算分离度受到很大程度的限制。
如图4所示，关键色谱峰对A，B，C色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值超过50%，无法精确测量基线峰宽以及半峰高处峰宽，这也是一些计算机数据处理系统无法给出一些关键峰对分离度的原因。
从理论上讲，组分经色谱柱分离之后被检测器检测到的信号强度分布在时间轴是高斯分布(正态分布)的，经由计算机结合色谱分离塔板理论对相邻组分的分离色谱图进行模拟(如下图5A及5B所示)。
将分离度大小(经由公式1或公式2计算得到)与两色谱峰峰高以及色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值进行关联，得到分离度与峰高比关系表(表1)，用于对重叠色谱峰分离度进行预测。
当然上述表格中预测方法也存在局限性，当两色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度之间比值大于90%时，由于两色谱峰严重重叠，两重叠色谱峰各自峰高均大于单独峰高(图5B，A)，此外当两重叠色谱峰高度比大于100时，峰高大的色谱峰几乎将小的色谱峰完全覆盖(图5B，C)，此时使用该方法得到的分离度显然是不符合实际情况的。
2. 影响分离度因素
多种因素可影响分离度的大小，其中为大家所熟知的是色谱柱的柱效，流动相的选择以及温度，流速等。此外，色谱峰的峰形，峰宽以及检测器相关参数的设置亦会影响分离度的大小。
2.1.色谱峰峰形与峰宽对分离度的影响
由检测器实际检测到的经由色谱柱流出组分的浓度响应信号强度，大多数情况下不是标准的高斯分布轮廓，可以色谱峰不对称因子以及色谱峰拖尾因子对色谱峰的峰形进行评价。不对称因子可按照As=B/A计算得到，其中B为10%峰高处后半部分色谱峰的峰宽，A为前半部分峰宽(如图6A所示)；拖尾因子可按照Tf=C/2D计算得到，其中C为5%峰高处峰宽，D为色谱峰前半部分峰宽(如图6B所示)。
一般地，不对称因子要≥拖尾因子，二者相对大小如下表2所述。
拖尾因子对于分离度的影响如下图7所示，随第一个色谱峰拖尾因子的增加，两色谱峰之间的分离度减小。
对于两个拖尾因子均为1.0的色谱峰来说，在不超载的情况下色谱峰的高度与色谱峰的宽度是相互独立的，而对于拖尾比较严重的色谱峰来说，色谱峰越高，其拖尾越严重，其色谱峰宽度越大，进而导致两色谱峰之间分离度降低(如图8所示)。
此外，无论是采取公式1，公式2计算还是采用色谱峰重叠处峰谷高度与较低色谱峰高度比值进行预测分离度，均无法避免拖尾因子对于分离度的影响。值得注意的是，拖尾因子较大导致分离度减小，一般只发生在前一色谱峰拖尾的情况，后一色谱峰拖尾对于分离度几乎无影响或影响很小(如图9所示)。
因此在对含有可游离基团化合物的分析时，通过调整pH改变色谱峰的出峰顺序，对于改善分离度是有裨益的。
2.2.DAD检测器采样频率对分离度的影响
用于精确定量的色谱分析方法，每个色谱峰需要20-25个点，采样频率的大小不仅影响色谱方法定量的准确性，也影响色谱峰之间的表观分离度，如下图10所示。
如上图所示，当由于采样频率引起色谱峰分离度较差，可适当增大采样频率来改善这种状况(如果色谱柱本身无法做到对待分离组分有效分离，该方法并无裨益)。
3. 结论
分离度可以按照保留时间，峰宽以及半峰宽计算，亦可以色谱柱柱效以及容量因子计算。此外也可以根据重叠两色谱峰的峰高比以及重叠处峰谷与较低色谱峰峰高比来预测分离度。无论采取哪种方式，均具有局限性，在实际情况下，需要根据相邻色谱峰的分离情况做出选择。此外，色谱峰拖尾因子以及检测器相关设置对于分离度的影响亦不容忽视。
Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
作者公众号：Pharma_Analytical
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